Ключевые слова:
Борнеол, камфора, «борнеолум», н-холинорецепторы, катехоламины, кальциевые каналы, натриевые каналы, фосфолипаза С, синдром Альцгеймера, болезнь Паркинсона, миорелаксанты, стресс, местные анестетики, никотиновая зависимость, синдром отмены.

Настоящее изобретение касается антагонистов н-холинорецепторов, которые содержат в качестве активного ингредиента борнеол или камфору. Точнее, настоящее изобретение относится к новому медицинскому применению композиций, содержащих борнеол (формула 1)



или камфору (формула 2), как показано ниже, в качестве активных ингредиентов, которые специфически ингибируют н-холинорецепторы, и тем самым играют важную роль в нервной деятельности, ингибируя секрецию катехоламинов. Вследствие чего борнеол и камфора могут быть эффективно использованы в качестве средства лечения заболеваний ЦНС, таких как синдром Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие, средства для местной анестезии, в качестве миорелаксантов и средств против стресса, средства для избавления от никотиновой зависимости, средства лечения синдрома отмены, и других.

Обоснование

Борнеол /borneol ([(lS)-endo]-1, 7,7-trimethylbicyclo [2. 2. 1] heptan-2-ol)/ и камфора /camphor ([lS]-endo)-1, 7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] heptan-2-one)/ являются бициклическими тритерпенами, имеющими 2 кольца и используемыми в качестве противовоспалительного средства (патент США US 5,889,049) и средства лечения расстройств, связанных с нитритом азота (патент США US 5,990,177), средства против перхоти в качестве дополнительного освежающего компонента (международный патент № 9939638) и ему подобные.

Они также используются в качестве средств против раздражения, для анестезии, создания ощущения свежести и т.д. (международный патент №9956548).

Борнеол и камфора совместно с гумуленом (humulene, 2,6,6,9-tetramethyl-1,4,8-cyclo- undecatriene) (формула 3) являются мажорными компонентами «борнеолума», являющегося средством китайской медицины.

В области Китайской медицины «борнеолум» является лекарственным компонентом, который широко используется для купирования теплового удара, при интоксикации, абдоминальной боли и т.д., в качестве освежающего средства, и известно как стимулятор ЦНС, как средство с антибактериальной активностью в отношении золотистого стафилококка, кишечной палочки, холерного вибриона, чумы свиней и т.д.

В Корее «борнеолум» в основном используется в качестве компонента препарата «Woowhang Chung Shim Won» (см. Korean Patent Publication No. 87-6998), а также используется в качестве средства для ароматизации воздуха в помещениях благодаря его специфическому запаху (Korean Laid-open Patent Publication No. 96-46125).

В то же время никогда глубоко не раскрывалось, что борнеол и камфора специфически воздействуют на н-холинорецепторы и поэтому могут быть использованы в качестве средства лечения различных расстройств, а именно, в качестве средства лечения заболеваний, относящихся к ЦНС, таких как синдром Альцгеймера, болезнь Паркинсона или Хонтингтона, в качестве средства для местной анестезии, миорелаксанта, средства против стресса, вспомогательного средства при запрете на курение, средства лечения синдрома отмены и т.д.

Дофамин, норадреналин и адреналин, обычно называемые катехоламинами, производятся из тирозина или фенилаланина в клетках мозга, мозгового вещества надпочечников, клетках симпатической нервной системы и т.д. Известно, что катехоламины играют важную роль в поведении, обусловленном стрессом или эмоциями ( Cooper JR, Bloom FE, Roth RH, 1991, The biochemical basis of neuropharmacology, pp. 220-284, Oxford University Press) и действуют как в периферической, так и в центральной НС. Когда сигнал извне поступает в нервные клетки, в них повышается уровень кальция, это является сигналом для выделения нейромедиаторов в синаптическую щель, что приводит к увеличению частоты сердечного ритма, дыхания, сокращению мышц, изменению метаболизма через изменение секреции инсулина и т.д. Поэтому множество лекарственных средств для лечения психозов и для анестезии действуют в области, относящейся к механизму секреции катехоламинов ( Seeman P, Van Tol HH, 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15 : 264-270).
Рецепторы для проведения сигналов, которые играют важную роль в секреции катехоламинов включают ацетилхолиновые рецепторы, которые делятся на м- и н-холинорецепторы в зависимости от сродственных им лигандов и механизма передачи сигнала в клетках. М-холинорецепторы проявляют свою активность под воздействием мускарина, алкалоида, содержащегося в грибах, также как и под воздействием ацетилхолина, и могут быть разделены на несколько подгрупп. Подгруппа м-холинорецепторов включает М2, который может открывать кальциевый канал путём активации Gi протеинов, М1, М3 и М5, которые соединяются с G протеинами типов Go, Gq и другими и активируют фосфолипазу С, и М4, который активирует Gi протеин, активируя аденилатциклазу. Как указывалось выше, хотя все м-холинорецепторы связываются с G протеинами, они демонстрирую разные ответы в зависимости от типа клеток. Тем временем, н-холинорецепторы соединяются с никотином так же, как с ацетилхолином, и проводят стимулирующие импульсы, которые могут длиться всего около 1/1000 секунды. Н-холинорецепторы образуют кальциевые и натриевые ионные каналы, которые могут открываться и закрываться связыванием с определёнными лигандами. Как было установлено выше, хотя м- и н-холинорецепторы различаются между собой с точки зрения механизма их действия, они являются холинорецепторами и поэтому в целом проявляют биологическую активность в отношении ряда функций центральной и периферической НС, включая контроль секреции нейромедиаторов, дыхание, аппетит, наркотическую интоксикацию, мышечную активность, память, сознание, концентрацию и т.д., которая существенно различается в зависимости от воздействующих на рецепторы лигандов.

Тема использования веществ, влияющих на рецепторы так же, как нейротрансмиттеры или гормоны, для лечения различных заболеваний изучалась широко и длительно. Например, Zantac и Tagamet как вещества, ингибирующие H2 гистаминовые рецепторы стали использовать для блокирования секреции HCl в желудке, а Salaracin как вещество, ингибирующее рецепторы ангиотензина – в качестве антигипертензивного средства.

Авторы настоящего изобретения провели поиск нового вещества, которое бы специфически воздействовало только на н-холинорецепторы. В результате мы идентифицировали борнеол и камфору, которые были известны только как освежающие и ароматические субстанции, в качестве веществ, специфически влияющих на н-холинорецепторы без воздействия на кальциевые каналы, натриевые каналы и рецепторы, связанные с фосфолипазой С, и поэтому могут быть использованы в качестве агентов для лечения расстройств, связанных с –н-холинорецепторной передачей с минимальными побочными эффектами, что послужило завершением данного изобретения.

Новизна изобретения

Целью настоящего изобретения являлось обнаружение соединения, которое специфически воздействует на н-холинорецепторы, ингибируя их активность и уменьшая секрецию катехоламинов, вследствие чего оно может быть использовано в качестве антагониста н-холинорецепторов.

Другой целю настоящего изобретения являлось обнаружение соединения, которое может быть использовано в качестве средства лечения расстройств, связанных с н-холинорецепторной передачей, имеющего минимальные побочные эффекты и высокий уровень безопасности.

Краткое описание рисунков

Рис 1. Секреция катехоламинов, вызываемая активацией н-холинорецепторов, ингибируется «борнеолумом»

Рис 2а. Секреция катехоламинов, вызываемая активацией н-холинорецепторов, ингибируется борнеолом

Рис 2б. Секреция катехоламинов, вызываемая активацией н-холинорецепторов, ингибируется камфорой

Рис 3а. Уровень ионов кальция в клетках, связанный с активацией н-холинорецепторов, ингибируется борнеолом

Рис 3б. Уровень ионов натрия в клетках, связанный с активацией н-холинорецепторов, ингибируется борнеолом

Рис 4а. Уровень ионов кальция в клетках, связанный с активацией н-холинорецепторов, ингибируется камфорой

Рис 4б. Уровень ионов натрия в клетках, связанный с активацией н-холинорецепторов, ингибируется камфорой

Рис 5. Увеличение уровня ионов кальция в клетках, связанное с активацией кальциевого канала (А), натриевого канала (Б) и рецепторов брадикинина связанных с фосфолипазой С (В) нечувствительно к борнеолу, где сплошная линия обозначает эксперимент с отсутствием воздействия борнеолом, а пунктирная – эксперимент при воздействии борнеолом 100 µM.

Лучший вариант осуществления изобретения

Для достижения указанных целей, настоящее изобретение предлагает антагонисты н-холинорецепторов, содержащие борнеол (формула 1) или камфору (формула 2); далее вещество [ (1R)-endo)- (+)-1, 7,7-trimethylbicyclo [2.2.1] heptan-2-ol, которое является энантиомером борнеола, демонстрирующим те же фармакологические эффекты, как борнеол и камфора (см выше). Указанные соединения специфически воздействуют на н-холинорецепторы, ингибируя секрецию катехоламинов и снижая уровень кальция и натрия в клетках, повышенный вследствие активации н-холинорецепторов.

Вследствие чего, указанные вещества могут быть эффективно использованы в качестве средств лечения расстройств ЦНС, связанных с активностью н-холинорецепторов, в качестве местных анестетиков, миорелаксантов, противострессорных средств, антидота при никотиновой интоксикации и вспомогательного средства при запрете на курение, средства лечения синдрома отмены и т.д. Расстройства ЦНС включают синдром Альцгеймера, болезни Паркинсона и Хантингтона и т.д.

Хотя вышеуказанные соединения в качестве средств лечения вышеупомянутых заболеваний могут быть изготовлены хорошо известным методом химического синтеза, их предпочтительно получать экстракцией из «борнеолума» (Dryobalanops aromatica Gaertner), который является сырьём китайской медицины. Использование экстракта «борнеолума», содержащего названные соединения, является более передовым, чем химический синтез, с точки зрения безопасности и стоимости производства.

Для лучшего воплощения настоящего изобретения, установлена 50% ингибирующая концентрация (IC50) борнеола, равная 70 µM и IC50 камфоры, равная 55 µM.

Так, эффективная доза соединений в соответствии с целями настоящего изобретения, равна 1.5-13.2 mg/kg, более предпочтительная 1.5-3.1 mg/kg.
Настоящее изобретение будет более полно раскрыто здесь и далее.

В целях предпочтительного осуществления данного изобретения мы исследовали соединения с антагонистической активностью в отношении н-холинорецепторов среди ряда видов сырья китайской медицины. Около 50 видов сырья Китайской медицины было экстрагировано горячей водой для получения соответствующего водного экстракта, который был изучен на клетках мозгового слоя надпочечников свиньи с целью обнаружения веществ, способных ингибировать секрецию катехоламинов, вызванную активацией н-холинорецепторов. В результате было обнаружено, что «борнеолум» обладает наивысшей активностью.

Мозговой слой надпочечников свиньи широко используется в качестве основной модели клеток для контроля секреции катехоламинов с тех пор, как было обнаружено, что они имеют свойства клеток как нервной, так и эндокринной системы, выделяя катехоламины под воздействием внешних стимулов (Park TJ, Shin SY, Suh BC, Suh EK, Lee IS, Kim YS, Kim KT, 1998, Synapse, 29: 248-256). Поэтому в настоящем изобретении использованы в качестве модели клетки мозгового слоя надпочечников свиньи. Уровень секреции катехоламинов измеряли введением меченого [3H]-норадреналина в клетки, обрабатывали эти клетки экстрактом «борнеолума» и затем измеряли радиоактивность в культурной среде определением количества [3H]-норадреналина выделенного клетками.

В результате секреция катехоламинов, вызванная активацией н-холинорецепторов была на 50% ингибирована «борнеолумом» в концентрации 6 мкг/мл и полностью ингибирована в концентрации 30 мкг/мл. Увеличение уровня кальция играет важную роль в секреции катехоламинов, увеличение уровня ионов кальция в клетках, вызванное активацией н-холинорецепторов, так же ингибировалась «борнеолумом». Далее, активация н-холинорецепторов также приводит к увеличению уровня ионов натрия в клетках, и оно также ингибировалось «борнеолумом».

Так как ингибирование увеличения уровня кальция и натрия в клетках как указано выше подобно эффекту ингибирования секреции катехоламинов, стало возможным идентифицировать, что секреция катехоламинов ингибировалась воздействием экстракта «борнеолума» непосредственно на н-холинорецепторы и ингибировало их активность.

Так же изучалось воздействие борнеола, который является составной частью «борнеолума» на секрецию катехоламинов. В результате было установлено, что борнеол эффективно ингибирует секрецию катехоламинов на 50-% при концентрации 70 мкМ, и на 100% при концентрации 300 мкМ. Увеличение уровня кальция и натрия в клетках, связанное с активацией н-холинорецепторов так же ингибировалось борнеолом в сходных пределах. Это показало, что борнеол прямо соединялся с н-холинорецепторами и ингибировал их активность, что и послужило ингибированию секреции катехоламинов.

Известно, что кальциевые каналы, натриевые каналы и рецепторы, связанные с фосфолипазой С так же как и н-холинорецепторы повышают уровень ионов кальция в клетках и вызывают секрецию катехоламинов. Соответственно, чтобы выяснить, является ли эффект борнеола и камфоры соответствующим целям настоящего изобретения – специфическим ингибированием н-холинорецепторов, были проведены эксперименты по изучению влияния борнеола и камфоры на повышение уровня ионов в клетках под воздействием активации кальциевых каналов, натриевых каналов или рецепторов, связанных с фосфолипазой С.

В результате было обнаружено, что «борнеолум» и борнеол не влияют на увеличение уровня ионов кальция в клетках благодаря активации кальциевых каналов, натриевых каналов или рецепторов, связанных с фосфолипазой С. Соответственно, «борнеолум» и его основной компонент борнеол специфически ингибируют только активность н-холинорецепторов и в итоге ингибируют секрецию катехоламинов.

Настоящее изобретение более подробно иллюстрируется следующими примерами.

Однако следует учесть, что данные примеры являются всего лишь иллюстрацией настоящего изобретения и ни в какой степени его не ограничивают.

Пример 1. Ингибирующий эффект «борнеолума» на секрецию катехоламинов благодаря активации н-холинорецепторов.
«Борнеолум» был экстрагирован на водяной бане в течение 3 часов и более для получения водного экстракта. Аликвоты экстракта были лиофилизированы и взвешены. Мозговое вещество надпочечников свиньи было разделено на мозговые клетки и корковые клетки под воздействием коллагеназы и затем только клетки мозговой ткани были обработаны коллагеназой, чтобы отделить клетки от ткани. Наконец, клетки были пропущены через тонкий нейлоновый фильтр для получения одиночных клеток, которые затем инкубировались 2-3 дня в DMEM/F12 среде (pH 7.4, Life Technologies, Inc.) для получения клеточной культуры.

Для определения секреции катехоламинов 1 µCi/ml радиоактивно-меченого [3H]-норадреналина и 0,1 mM витамина С были добавлены в среду мозговых клеток надпочечников и интродуцировались в клетки инкубацией в течение часа при 37°C. Затем [3H]-норадреналин, который не был интродуцирован в клетки, отмыли раствором Локка (154 mМ NaCl, 5,6 mM KCl, 5,6 mM глюкозы, 1 mM CaCl, 1 mM MgCl2 и 5 mM буфера Hepes, рН 7,4). Клетки были обработаны различными концентрациями экстракта «борнеолума» в течение 10 минут, затем среда была собрана. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинцилляционном счётчике, чтобы определить количество [3H]-норадреналина, секретированного клетками.

Рис 1. Секреция [3H]-норадреналина вызванная обработкой DMPP (1, 1-dimethyl-4-phenylpiperazineium iodide), который известен как специфический активатор н-холинорецепторов, была частично или полностью ингибирована в зависимости от концентрации «борнеолума». «Борнеолум» демонстрировал 50% ингибирующий эффект при концентрации 6 мг/мл и 100% ингибирующий эффект при концентрации 30 мг/мл.

Пример 2. Ингибирующий эффект борнеола на секрецию катехоламинов, вызванную активацией н-холинорецепторов. Этот тест проводился в соответствии с вышеописанной процедурой, кроме того, что экстракт «борнеолума» был заменён борнеолом (Sigma, USA).

Рис.2. Секреция [3H]-норадреналина вызванная обработкой DMPP (1, 1-dimethyl-4-phenylpiperazineium iodide), была частично или полностью ингибирована в зависимости от концентрации борнеола, который является основным действующим веществом «борнеолума». Борнеол демонстрировал 50% ингибирующий эффект при концентрации 70 µМ и 100% ингибирующий эффект при концентрации 300 µМ. Следовательно, ингибирующий эффект «борнеолума» связан с его основным действующим веществом – борнеолом.

Пример 3. Ингибирующий эффект камфоры на секрецию катехоламинов, вызванную активацией н-холинорецепторов. Этот тест проводился в соответствии с вышеописанной процедурой, кроме того, что экстракт «борнеолума» был заменён камфорой (Sigma, USA).
В результате было обнаружено, что камфора проявляет 50% ингибирующего эффекта в концентрации 55 µМ.

Пример 4. Ингибирующий эффект борнеола на увеличение уровня кальция и натрия в клетках под воздействием активации н-холинорецепторов.
1) Воздействие на уровень ионов кальция. Для определения изменений уровня кальция в клетках флюоресцент fura-2/AM (Molecular Probe Inc., USA), который способен флуоресцировать, связываясь с ионами кальция, вводился в клетки путём добавления в среду в концентрации 3 µМ и последующей инкубацией в течение 40 мин при 37°C. Затем избыток fura-2/AM отмывали. УФ облучение производилось на спектрофлуориметре при 340 nm и 380 nm, и затем флуоресцентная эмиссия при 500 нм измерялась с целью определения степени увеличения уровня кальция в клетках. Из полученных данных уровень кальция в клетках мог быть количественно определён с помощью уравнения (1): (Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY, 1985, J. Biol. Chem., 260: 3440-3450)

Са = Kp [ (R-Rmin)/ (Rmax-R)]/ (Sf2/Sb2)

Где
Kp – константа диссоциации комплекса fura-2/AM и кальция
R – степень флуоресценции при 340 нм и 380 нм
Rmin – степень флуоресценции при уровне Са = 0
R Rmax – степень флуоресценции при уровне Са = степени насыщения
Sf2 – объём флуоресцента при уровне Са = 0
Sb2 - объём флуоресцента при уровне Са = степени насыщения

Рис 3а. Увеличение уровня кальция в клетках, которое наблюдается после обработки DMPP, частично или полностью ингибируется борнеолом, при повышении его концентрации.

2) Воздействие на уровень ионов натрия. Для определения изменений уровня натрия в клетках флюоресцент SBFI (sodium-binding benzofuran isophthalate, Molecular Probe Inc., USA), который способен флуоресцировать, связываясь с ионами натрия, был интродуцирован в клетки, а его избыток удалён. УФ облучение производилось на спектрофлуориметре при 340 nm и 380 nm, и затем флуоресцентная эмиссия при 530 нм измерялась с целью определения степени увеличения уровня кальция в клетках. Из полученных данных уровень натрия в клетках мог быть количественно определён с помощью уравнения, описанного выше (1).

Рис 3б. Увеличение уровня натрия в клетках, которое наблюдается после обработки DMPP, являющимся специфическим активатором н-холинорецепторов, частично или полностью ингибируется борнеолом, при повышении его концентрации.

Из вышеописанного следует, что если ингибирующий эффект борнеола на увеличение уровня Са и Na благодаря активации н-холинорецепторов сходен с ингибирующим эффектом борнеола на секрецию катехоламинов, можно утверждать, что борнеол прямо ингибирует н-холинорецепторы.

Пример 5. Ингибирующий эффект камфоры на увеличение уровня кальция и натрия в клетках под воздействием активации н-холинорецепторов определяли в соответствии с процедурой, описанной в примере 4, заменяя борнеол камфорой.

Рис 4. Камфора ингибирует увеличение уровня ионов Са в концентрации около 88 µМ и на 50% ингибирует увеличение уровня ионов натрия в концентрации 19 µМ.

Пример 6. Ингибирующий эффект борнеола на увеличение уровня кальция в клетках, вызванное активацией кальциевых каналов, натриевых каналов и рецепторов фосфолипазы С. Чтобы подтвердить или опровергнуть, является ли ингибирование увеличения уровня натрия и кальция в клетках борнеолом и камфорой результатом специфического ингибирования н-холинорецепторов, был проведён тест по определению способности борнеола снижать уровень кальция в клетках, повышенный за счёт активации кальциевых каналов, натриевых каналов и рецепторов фосфолипазы С. Для активации только кальциевых каналов клетки были обработаны хлоридом калия в такой высокой концентрации, как 70 mM, чтобы активировать потенциал-зависимый кальциевый канал, натриевый канал был активирован обработкой вератридином и брадикининовый рецептор фосфолипазы С был обработан брадикинином. Борнеол добавляли в концентрации 100 µМ или не добавляли вовсе (контроль).
Специфический метод определения изменений уровня кальция в клетках был описан в примере 4.

Рис 5а. Борнеол не оказывает влияния на увеличение уровня кальция в клетках, которое наблюдается при обработке клеток высоко концентрированным раствором калия хлорида для активации потенциал-зависимых кальциевых каналов
Рис 5 б Борнеол не оказывает влияния на увеличение уровня кальция в клетках, которое наблюдается при обработке клеток вератрином, который известен способностью активировать потенциал-зависимые натриевые каналы
Рис 5 в Борнеол не оказывает влияния на увеличение уровня кальция в клетках, которое наблюдается при обработке клеток брадикинином, который активирует брадикининовые рецепторы, связанные с фосфолипазой С.

В результате можно видеть, что борнеол не оказывает активирующего влияния на кальциевые каналы, натриевые каналы и рецепторы, связанные с фофолипазой С, каждый из которых играет важную роль в передаче сигналов в нервных клетках.

Практическое применение. В соответствии с настоящим открытием борнеол и камфора специфически воздействуют на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, ингибируя секрецию катехоламинов, и поэтому могут быть эффективно использованы в качестве средства лечения заболеваний, связанных с н-холинорецепторами, которые обладают низкой возможностью развития побочных эффектов и являются высокобезопасными.

В частности, они могут быть с успехом использованы в качестве средств лечения заболеваний ЦНС, средств местной анестезии, миорелаксантов, средств против стресса, адьювантов (вспомогательных средств) при запрете на курение, средства лечения синдрома отмены и т.д.






Оригинал патента *.pdf

Ссылка на страницу ( количество переходов по ссылке: 261 )
 http://pharm-forum.ru/uploads/01058436.pdf