«УТВЕРЖДАЮ»
Директор НИИ фармакологии
ТНЦ СО РАМН, академик РАМН
Е.Д.Гольдберг
27 октября 2000 г.

ОТЧЕТ № 1
об изучении влияния биологически активной добавки Маммолептин на развитие экспериментальных опухолей

Томск – 2000 г.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 55 мышах-самках беспородных, 30 линии С₅₇В1/₆ и 58 линии F₁ (СВАхС₅₇В1/₆), полученных из научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат № 161-99). Животные содержались в типовом виварии на обычном рационе питания. Перед началом опыта мышей выдерживали с целью адаптации к условиям вивария в течение 8-10 дней (по 10-12 особей в пластмассовой клетке).

1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕВЫХ ШТАММОВ

Аденокарцинома Эрлиха (АКЭ). Солидная аденокарцинома Эрлиха возникла из спонтанного рака молочной железы мыши в 1905 году. Асцитный вариант был получен в 1932 году путем внутрибрюшинных перевивок солидной аденокарциномы Эрлиха. Опухоль перевивается внутрибрюшинно или подкожно асцитической жидкостью беспородным мышам на 8-12 сутки роста, средняя продолжительность жизни животных составляет 12-20 суток. При внутрибрюшинной перевивке образуется асцит с большим количеством опухолевых клеток. Не метастазирует. В эксперименте использован метод перевивки опухоли: внутрибрюшинно, 7,5 млн клеток в 0,2 мл физиологического раствора. Опыт заканчивали на 9 сутки развития опухоли.

Карцинома легких Льюис (3LL). Опухоль возникла спонтанно как карцинома легких мышей линии С₅₇В1/₆ в 1951 году. Перевивается на 12-14 сутки роста, средняя продолжительность жизни животных - 24 дня. Метастазирует гематогенно в легкие практически в 100% случаев. Считается, что эта опухоль по чувствительности к противоопухолевым препаратам аналогична солидным опухолям человека: адекватный экспериментальный поиск антиметастатических средств стал возможен лишь после введения в практику метастазирующего рака мышей Льюис. В экспериментах опухоль перевивали внутримышечно, 5 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Опыт заканчивали на 21 сутки развития опухоли.

Меланома В-16 (В-16). Опухоль возникла спонтанно в коже мыши линии С₅₇В1/₆ около глаза в 1954 году. Штамм поддерживается на мышах линии С₅₇В1/₆ подкожной перевивкой опухолевой взвеси на 16-20 сутки роста опухоли. Средняя продолжительность жизни - 30-40 дней. Метастазирует преимущественно гематогенно в легкие. В опытах перевивку производили внутримышечно 5 млн опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Эксперимент заканчивали на 19 сутки развития опухоли.

Рак легкого-67 (РЛ-67). Опухоль перевивается на 12-14 сутки роста, средняя продолжительность жизни мышей - 36 дней. Метастазирует преимущественно гематогенно в легкие практически в 100% случаев. В опытах перевивали внутримышечно по 5 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Эксперимент заканчивали на 18 сутки развития опухоли.

1.2. МЕТОДЫ ПЕРЕВИВКИ ОПУХОЛЕЙ

Трансплантацию солидных опухолей (3LL, В-16, РЛ-67) производили гомогенатом опухолевой ткани в стерильном физиологическом растворе. Животных-доноров умерщвляли, вырезали кусочки опухоли без некротических участков и измельчали их через пресс-измельчитель. Полученную массу опухоли разводили физиологическим раствором и вводили мышам внутримышечно по 5 млн опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора, предварительно подсчитывая их число под микроскопом.
     Асцитную опухоль Эрлиха перевивали асцитической жидкостью, полученной от мышей-доноров на 8-10 сутки после инокуляции, разведенной физиологическим раствором. Полученную взвесь, содержащую в 0,2 мл 7,5 млн клеток опухоли, вводили животным внутрибрюшинно [ 2 ].

1.3. ОСНОВНЫЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЯЕМЫХ ЛЕЧЕБНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ

Процент торможения роста опухоли (по массе опухолевого узла или объему опухолевых клеток в асцитном варианте) вычисляли по формуле:

Средний объём (или масса) опухоли в контрольной группе – Средний объём (или масса) опухоли в опытной группе
	х 100 %
Средний объём (или масса) опухоли в контрольной группе

Определение объема клеток опухоли Эрлиха проводилось после центрифугирования асцитической жидкости в мерной пробирке в течение 5 мин при 3000 оборотах.

При оценке интенсивности процесса метастазирования использовали несколько критериев:

1. частоту метастазирования опухолей вычисляли в процентах (по отношению числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе);
2. в случае гематогенного метастазирования определяли среднее количество метастазов у одного животного в группе. Среднюю площадь метастатического поражения высчитывали, определяя при этом диаметр метастазов. Учитывалось , что при использовании карциномы легких Льюис, меланомы В-16 и рака легкого-67 метастазы располагались преимущественно субплеврально;
3. величину различия в метастазировании опухоли между контролем и опытом оценивали по индексу ингибирования метастазирования (ИИМ):

	(A1 x B1) - (A2 x B2)
ИИМ =		х 100 %, где
	(A1 x B1)

A₁ - частота метастазирования в контрольной группе; А₂ - частота метастазирования в опытной группе; B₁ - среднее количество метастазов у животных контрольной группы; В₂ - среднее количество метастазов у животных опытной группы.

     По окончании экспериментов животных умерщвляли, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противометастатическому и противоопухолевому действию препаратов.

1.4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев U - Вилкоксона-Манна-Уитни и j - углового преобразования Фишера. Различия считали достоверными при Р<0,05 [ 1 ].

1.5. ДОЗЫ И РЕЖИМ ВВЕДЕНИЯ МАММОЛЕПТИНА

Препарат растворяли в дистиллированной воде и вводили зондом в желудок в дозах 0,384 и 1,024 г/кг мышам с асцитной опухолью Эрлиха через 24 часа после перевивки и продолжали ежедневно в течение 7 суток; животным с солидными опухолями - на 4-5 сутки после перевивки и продолжали ежедневно в течение 13-16 суток. Используемые в экспериментах дозы соответствовали рекомендуемым для приема человеку начальной дозировке (по 2 капсулы 3 раза в день) и терапевтической дозе (5 капсул 3 раза в день). Пересчет производился по таблице Freirich E. J, [3] . Контрольные группы животных получали эквиобъемное количество дистиллированной воды в дни введения Маммолептина.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. ИЗУЧЕНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ МАММОЛЕПТИНА

Острая токсичность Маммолептина изучена на 24 беспородных мышах-самках массой 20 г, полученных из научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат № 161-99).
     Маммолептин вводили однократно внутрижелудочно через зонд, растворяя в дистиллированной воде в дозах 1, 2,5; 5 и 10 г/кг. Наблюдение за животными проводили в течение двух недель. Смертности животных, а также каких-либо патологических проявлений их поведения, общего состояния не наблюдалось. Все животные были активны, рефлексы сохранены, шерсть гладкая, блестящая, пищеварение в норме.
     На основании полученных данных изучения острой токсичности Маммолептин можно отнести к относительно безвредным веществам (4 класс - малоопасные по ГОСТ 12.1.007-76).

2.2. ВЛИЯНИЕ МАММОЛЕПТИНА НА РАЗВИТИЕ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА У МЫШЕЙ

В эксперименте на беспородных мышах-самках массой 18 г изучено влияние Маммолептина на рост асцитной опухоли Эрлиха, оценку противоопухолевого действия производили на 9 сутки развития опухоли. Показано, что курсовое введение животным исследуемого средства в дозе 1,024 г/кг приводило к достоверному торможению роста опухоли (30%), объем опухолевых клеток при этом уменьшился в 1,4 раза (Р_u<0,01) по сравнению с таковым в контроле. Следует отметить, что в группе мышей, получавших Маммолептин в дозе 0,384 г/кг прослеживалась тенденция к торможению роста опухоли - ее объем при этом уменьшился в 1,2 раза по сравнению с контролем, однако это изменение не было статистически значимым (табл.1).
      Таким образом, при введении Маммолептина в дозах 0,384 и 1,0-24 г/кг мышам с аденокарциномой Эрлиха не выявлено стимулирующего действия препарата на развитие опухоли. Более того, при использовании Маммолептина в большей дозе (1,024 г/кг) отмечен достоверный противоопухолевый эффект.

2.3. ВЛИЯНИЕ МАММОЛЕПТИНА НА РАЗВИТИЕ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС У МЫШЕЙ-САМОК ЛИНИИ C₅₇Bl/₆

Противоопухолевое и противометастатическое действие Маммолептина изучено в эксперименте на мышах-самках линии С₅₇В1/₆ с перевиваемой карциномой легких Льюис. Как видно из таблицы 2, Маммолептин, применяемый для лечения животных в дозах 0,384 и 1,024 г/кг, не влиял на развитие основного опухолевого узла (масса опухоли у животных опытных групп практически не отличалась от контрольных значений). Не отмечено также влияния Маммолептина на такие показатели процесса метастазирования, как частота (во всех группах мышей она составила 100%) и количество метастазов в легких. Площадь метастатического поражения у животных, леченных Маммолептином в меньшей дозе, не отличалась от таковой в контрольной группе, а у получавших исследуемое средство в большей -оказалась в 1,6 раза меньше контрольных значений, однако это изменение не было статистически значимым.
      Таким образом, на модели перевиваемой мышам карциномы легких Льюис не отмечено стимулирующего эффекта препарата (в дозах 0,384 и 1,024 г/кг) на рост первичной опухоли и метастазов. В то же время, отмечена тенденция к ингибированию процесса метастазирования опухоли при лечении животных Маммолептином в дозе 1,024 г/кг.

2.4. ВЛИЯНИЕ МАММОЛЕПТИНА НА РАЗВИТИЕ РАКА ЛЕГКОГО-67 У МЫШЕЙ-САМОК ЛИНИИ F₁(CBA x C₅₇Bl/₆)

Эксперимент проведен на мышах-самках линии F₁(CBA x С₅₇В1/₆) массой 18г с перевиваемым раком легкого-67. Показано, что введение мышам Маммолептина в дозах 0,384 и 1,024 г/кг достоверно не влияло на рост основного опухолевого узла. Показатели процесса метастазирования у мышей, леченных Маммолептином в дозе 0,384 г/кг не отличались от контрольных значений. В то же время, у мышей, получавших Маммолептин в большей дозе {1,024 г/кг), наблюдалась тенденция к уменьшению количества метастазов (в 1,3 раза), их площади (в 2,9 раза) по сравнению с контрольными значениями и снижению частоты метастазирования (со 100% в контроле до 8 0%). Однако, описанные изменения не были статистически значимыми.
      Таким образом, в эксперименте с использованием модели рака легкого-67 мышей Маммолептин в используемых дозах не оказал влияния на развитие опухоли и метастазов.

2.5. ВЛИЯНИЕ МАММОЛЕПТИНА НА РАЗВИТИЕ МЕЛАНОМЫ В-16 У МЫШЕЙ-САМОК ЛИНИИ F₁(СВА х С₅₇В1/₆)

В эксперименте использовали мышей-самок линии F₁(CBA х С₅₇В1/₆) массой 17г. Показано, что Маммолептин в исследуемых дозах не оказывал влияние на развитие меланомы В-16: масса первичного опухолевого узла в контрольной и опытных группах мышей достоверно не различалась. Количество метастазов и площадь метастатического поражения в группах животных, получавших курсовое введение Маммолептина, было на уровне контрольных значений (табл.4). Следует отметить, что частота метастазирования у нелеченых мышей с меланомой В-16 составила 90%, тогда как введение изучаемого средства растительного происхождения при использовании в обеих дозах привело к уменьшению этого показателя до 60% (Р_j<0,053).
      Таким образом, в эксперименте на мышах с меланомой В-16 не обнаружено достоверного влияния Маммолептина на рост опухоли и метастазов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании эксперимента по изучению острой токсичности Маммолептина можно сделать вывод о том, что препарат не обладает токсичностью и может быть отнесен к относительно безвредным веществам (4 класс - малоопасные по ГОСТ 12.1.007-76).
      Результаты экспериментов, полученные на мышах с перевиваемыми опухолями аденокарциномой Эрлиха, карциномой легких Льюис, раком легкого-67 и меланомой В-16 позволяют сделать вывод о том, что биологически активная добавка Маммолептин в используемых дозах и режимах введения не обладает стимулирующим влиянием на рост первичных опухолей и развитие процесса метастазирования. Следует отметить, что использование препарата в большей дозе вызывало достоверное торможение роста асцитной опухоли Эрлиха. Прослеживалась тенденция к игибированию процесса метастазирования солидных опухолей при лечении животных Маммолептином в дозе 1,024 г/кг.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - 193 с.
2. Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - 296 с.
3. Freireich E.J. et al. Chemotherapy National Cancer Instityt, 1967.

Ответственный исполнитель:
Зуева Е.П., доктор биол. наук,
руководитель группы онкофармакологии
НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Таблица 1 Влияние Маммолептина на развитие аденокарциномы Эрлиха у беспородных мышей-самок

Группа наблюдения Количество животных в группе Доза препарата (г/кг)/интервал (ч) х число введений Объем асцитической жидкости, мл (Х±m) Объем опухолевых клеток, мл (Х±m) Торможение роста опухоли, % 1. Контроль 11 - 7,63±0,55 3,44±0,14 - 2. Маммолептин 10 0,384/24 х 7 6,84±0,62 2,82±0,28 18 3. Маммолептин 10 1,024/24 х 7 6,03±0,52 1-ЗРu<0,05 2,40±0,16 1-ЗРu<0,05 30

Примечание. В таблицах перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп.

Таблица 2 Влияние Маммолептина на развитие карциномы легких Льюис у мышей-самок C57B1/6

Группа наблюдения (количество мышей в группе) Доза препарата (г/кг)/ интервал (ч) х число введений (Х±т) Торможение роста опухоли, % Частота метаста- зирования % Масса легких, мг (Х±т) Количество метастазов на одну мышь (Х±т) Площадь метастазов на одну мышь, мм2 (Х±т) ИИМ, % 1. Контроль (11) - 6,09±0,34 - 100 243,0±9,30 24,82±3,42 21,42±5,14   2. Маммолептин (10) 0,384/24 х 16 5,72±0,29 6 100 239,6±11,78 27,80±3,78 22,50±7,10 +12 3. Маммолептин (9) 1,024/24 х 16 5,92±0,21 3 100 222,3±8,06 24,11±2,73 13,61±1,78 3

Таблица 3 Влияние Маммолептина на развитие рака легкого-67 у мышей-самок линии F1 (CBA x C57B1/6)

Группа наблюдения (количество мышей в группе) Доза препарата (г/кг)/ интервал (ч) х число введений (Х±т) Торможение роста опухоли, % Частота метаста- зирования % Масса легких, мг (Х±т) Количество метастазов на одну мышь (Х±т) Площадь метастазов на одну мышь, мм2 (Х±т) ИИМ, % 1. Контроль (10) - 5,05±0,38 - 100 152,00±5,58 3,20±0,57 0,97±0,36 2. Маммолептин (9) 0,384/24 х 13 6,02±0,25 +19 100 163,67±5,97 4,56±0,88 1,28±0,54 +43 3. Маммолептин (9) 1,024/24 х 13 4,90±0,51 2,9 80 156,33±6,58 2,56±0,77 0,341±0,17 36

Таблица 4 Влияние Маммолептина на развитие меланомы В-16 у мышей-самок линии F1 (CBA x C57B1/6)

Группа наблюдения (количество мышей в группе) Доза препарата (г/кг)/ интервал (ч) х число введений (Х±т) Торможение роста опухоли, % Частота метаста- зирования % Масса легких, мг (Х±т) Количество метастазов на одну мышь (Х±т) Площадь метастазов на одну мышь, мм2 (Х±т) ИИМ, % 1. Контроль (10) - 5,64±0,22 - 90 147,60±4,85 5,10±1,73 0,54±0,23   2. Маммолептин (10) 0,384/24 х 14 5,03±0,44 +11 60 1-2Pj <0,05 3 158,40±2,86 5,10±2,20 0,37±0,16 33 3. Маммолептин (10) 1,024/24 х 14 5,14±0,32 9 60 170,20±5,70 1-3Pj <0,05 5,20±0,82 0,40±0,21 33

При полном или частичном использовании материалов сайта ссылка на www.mammoleptin.ru ОБЯЗАТЕЛЬНА

Группа компаний "ДАО-ФАРМ", Россия, Москва, год основания 1995, представляет на российском фармацевтическом рынке лучшие препараты традиционной китайской медицины.
Эксклюзивный поставщик: ООО "ТК-Фарм"